MANUAL OPERACIONAL TÉCNICO – TERAPIA CELULAR AUTÓLOGA COM ADMSCs

🧬 MANUAL OPERACIONAL TÉCNICO – TERAPIA CELULAR AUTÓLOGA COM ADMSCs

(Isolamento, Expansão e Aplicação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo)

1️⃣ EQUIPE HUMANA ENVOLVIDA

Profissional	Função	Formação/Experiência Requerida
Médico responsável	Coleta (lipoaspiração), reinjeção e acompanhamento clínico	Cirurgião plástico, ortopedista ou médico com formação em cirurgia e credenciamento ANVISA para manipulação autóloga
Biólogo / Biomédico celular	Processamento, isolamento e cultura celular	Treinamento GMP e experiência com cultura primária humana
Farmacêutico-bioquímico	Controle de qualidade, esterilidade e rastreabilidade	Especialização em biotecnologia ou manipulação celular
Técnico de laboratório	Apoio técnico em manipulação, centrifugação, controle de insumos	Experiência em cultura de células humanas
Enfermeiro de sala	Assistência ao ato cirúrgico e manutenção do campo estéril	Experiência em pequenos procedimentos ambulatoriais
Coordenador de biossegurança	Controle ambiental, monitoramento GMP, descarte	Treinamento NR-32 e RDC 50

2️⃣ INSTALAÇÕES E INFRAESTRUTURA

Setor	Equipamentos obrigatórios	Observações
Sala limpa Classe B (GMP)	Cabine de segurança biológica Classe II A2, fluxo laminar vertical, pressão positiva	Esterilização UV e controle de partículas ISO 7
Sala cirúrgica de coleta	Cama cirúrgica, aspirador, luz cirúrgica, monitor multiparamétrico	Circuito fechado entre sala e laboratório
Sala de cultura celular	Incubadora de CO₂ (trigás preferencial), microscópio invertido, contadora automática de células	Temperatura constante 37 °C ± 0,5
Sala de lavagem/centrifugação	Centrífuga refrigerada (15/50 mL), controle de velocidade e tempo	RPM ajustável até 3000 g
Área de criopreservação (opcional)	Freezer −80 °C, tanque de nitrogênio líquido (fase vapor), sistema de alarme	Termômetro digital e registro contínuo
Vestiário de paramentação	EPI, pia sem contato, esterilizadores UV de mãos	Fluxo unidirecional (entrada → saída)

2.3 REQUISITO DE INCUBAÇÃO E CULTURA CELULAR

Especificação da Incubadora

Parâmetro	Recomendação GMP	Justificativa
Tipo	Incubadora de CO₂ trigás (CO₂/O₂/N₂)	Permite controle de hipoxia fisiológica (3–5% O₂)
CO₂	5% ± 0,1% (sensor IR)	Estabiliza o pH do meio
O₂	3–5%	Favorece proliferação e perfil secretômico
Temperatura	37 °C ± 0,1 °C	Mantém homeostase metabólica
Umidade relativa	≥95%	Evita evaporação do meio
Câmara interna	Cobre antimicrobiano / aço inox polido	Reduz contaminação microbiana
Descontaminação	Ciclo seco (180 °C) ou H₂O₂/UV validado	Previne biofilme e contaminações
Filtragem interna	HEPA classe H14 + filtros 0,2 µm nos gases	Ar estéril e limpo
Registro e alarmes	Data logger / Ethernet / alarmes de CO₂, O₂, T°	Rastreabilidade

Suprimentos e infraestrutura

• Cilindros de CO₂, N₂ e O₂ grau medicinal com reguladores e mangueiras estéreis.
• Nobreak dedicado e gerador de emergência.
• Ambiente ISO 7, longe de vibração e calor.
• Bandeja d’água estéril, sensores calibrados, kits de limpeza compatíveis.

Parâmetros de Cultura

• T: 37 °C
• CO₂: 5%
• O₂: 3–5% (hipoxia fisiológica)
• Umidade: ≥95%
• Meio: α-MEM/DMEM-F12 xeno-free + HSA 5–10% + bFGF 5 ng/mL
• Subcultivo: confluência 70–80%, tripsina 3–5 min.

Boas Práticas

1. Qualificação IQ/OQ/PQ documentada.
2. Calibração semestral CO₂/O₂/T°.
3. Descontaminação mensal.
4. Troca da bandeja d’água 2×/semana.
5. Teste de micoplasma mensal.
6. Registro contínuo de T°, CO₂ e O₂.

Complementos essenciais:

Cabine Classe II A2, centrífuga refrigerada, microscópio invertido e contador celular automático.

3️⃣ MATERIAIS CIRÚRGICOS E DE COLETA

Material	Especificação	Quantidade
Cânula de lipoaspiração	3 mm, romba, ponta múltipla, estéril	1 por paciente
Seringas Luer-Lock	10, 20, 60 mL (Toomey)	conforme volume
Filtros estéreis	0,22 µm para reagentes	2–3
Frascos de coleta	Sistema fechado (ex. Lipokit® 250 mL)	1
Solução tumescente	Lidocaína 0,05–0,1% + adrenalina 1:500 000 + soro fisiológico	conforme área
Cateter flexível / cânula de retorno	2–2,5 mm, ponta romba	1
Curativos compressivos	–	conforme área

4️⃣ MATERIAIS DE LABORATÓRIO

Categoria	Item	Especificação
Recipientes	Tubos Falcon 15/50 mL, frascos T-25/T-75	Polipropileno estéril
Cultura celular	Meio DMEM/F12 ou α-MEM xeno-free	Grau GMP
	Soro humano AB	5–10%
	bFGF	5 ng/mL
	Antibióticos (Pen/Strep/Anfotericina B)	Grau USP
Digestão enzimática	Colagenase tipo I/II (0,075–0,1%)	Grau GMP
Análise celular	Azul de Tripan 0,4%; citometria CD73/90/105; microscópio invertido	–
Centrifugação	Rotor basculante 300–1200 g	Controle digital
Lavagem/Neutralização	PBS + HSA 1%	–
Criopreservação	DMSO 10% + albumina humana 5% + PlasmaLyte A	Grau GMP
Armazenamento	Freezer −80 °C ou LN₂	Monitorado

5️⃣ TESTES DE QUALIDADE E LIBERAÇÃO

Ensaio	Método	Critério
Viabilidade	Azul de Tripan / Flow	>90%
Contagem total	Câmara Neubauer / automatizado	≥10×10⁶ células/dose
Esterilidade	Cultura aeróbia/anaeróbia (Bactec®)	Negativa até 14 dias
Endotoxinas	LAL (Limulus)	<5 EU/kg/h
Imunofenótipo	Citometria de fluxo	CD73+/CD90+/CD105+ >95%
Cariótipo	Bandamento G / FISH	46,XX/XY normal
Micoplasma	PCR	Negativo
Potência (opcional)	ELISA ou supressão linfocitária	Dentro do padrão interno

6️⃣ EQUIPAMENTOS DE SUPORTE E SEGURANÇA

• Autoclave Classe B
• Estufa de secagem 60 °C
• Seladora térmica de tubos
• Medidor de partículas e termohigrômetro
• Kit de derramamento biológico e EPI (luvas, avental, máscara N95, protetor facial)
• Sistema de descarte classe B (biológicos humanos)
• Gerador e alarme de temperatura (freezers/incubadoras)

7️⃣ DOCUMENTAÇÃO E RASTREABILIDADE

• Formulário de rastreio do paciente (ID, lote, data, volume, operador)
• Registro de lotes de reagentes e colagenase
• Check-list de calibração e limpeza
• Controle ambiental (partículas e UFC)
• Livro de cultura: passagens, datas, confluência, QC
• Termo de consentimento ampliado (uso experimental)
• Plano de descarte e biossegurança

8️⃣ OBSERVAÇÃO OPERACIONAL

A execução segura e validada requer sala limpa ISO 7/Classe B, fluxo estéril ininterrupto da coleta ao cultivo e registro de tempo total inferior a 4 h entre aspiração e semeadura.

Todos os reagentes devem ser GMP-grade, e a equipe deve possuir treinamento documentado em manipulação celular humana e biossegurança nível 2.